VLDLR增强胰腺星状细胞脂质代谢和亚油酸产生，激活ILC2细胞促进胰腺纤维化

胰腺炎（Chronic pancreatitis，CP）是一种广泛发生的纤维化炎性疾病，其特点是胰腺急性炎症和慢性炎症反复发作，最终导致纤维化、内分泌和外分泌异常。酗酒是CP的主要诱因之一。酗酒会诱导脂蛋白代谢紊乱，例如甘油三酯（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）颗粒和游离脂肪酸（FAs）的上调，造成异常的脂质累积，促进氧化应激，导致组织炎症和纤维化。胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)是一种间质细胞，主要生理功能是储脂，病理因素刺激激活PSCs转化为成纤维细胞样细胞，促进胰腺导管癌和CP相关的纤维化进程。炎症会造成胰腺纤维化。最近的研究发现，脂蛋白吸收异常和脂质累积会造成胰腺炎的促炎微环境，然而，脂质代谢紊乱在胰腺纤维化及PSCs过度增殖中的作用及机制却尚不清楚。

IL-33是一种典型的2型免疫反应促进因子，通过激活肌成纤维细胞和ILC2相关2型免疫反应促进多种纤维化疾病。研究发现IL-33在CP中表达水平升高，然而，IL-33来源及其对PSCs的作用有待探究。2022年7月12日，复旦大学上海医学院的林玉丽团队与上海中医药大学附属龙华医院的杨旭光团队在 Immunity 上发表了题为《Very-low-density lipoprotein receptor-enhanced lipid metabolism in pancreatic stellate cells promotes pancreatic fibrosis》的文章，发现胰腺炎组织中存在脂代谢高度活跃的PSC亚群，该亚群高表达极低密度脂蛋白受体VLDLR，VLDL摄取能力增强。VLDL进入PSC后降解为亚油酸（LA），LA一方面促进转录因子EBF2与IL-33启动子结合上调IL-33的表达，另一方面造成ROS累积，导致氧化应激和内质网应激，促进IL-33的分泌。IL-33和ILC2细胞的ST2受体结合促进2型免疫细胞激活和成纤维细胞的增殖，最终导致胰腺纤维化。该研究系统阐明了脂代谢调控PSCs活化促进胰腺炎纤维化的机制，明确了脂代谢在胰腺炎微环境中的调控作用，为改善代谢紊乱相关的纤维化疾病提供了新策略。

单细胞测序分析发现CP中存在脂代谢活跃的PSC亚群

为了探究CP发生的分子机制，作者利用酒精诱发的CP小鼠模型进行了scRNA-seq，确定了12个细胞类型，包括PSC （Pdgfra和Col1a1）、腺泡细胞、导管细胞、内皮细胞、周细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和ILC2细胞。其中PSCs是主要的细胞类型（占比43.8%），与CP组织中成纤维丰富的临床观察相一致。

为了更好地了解PSC的异质性和表型差异，作者对PSC进行重聚类鉴定了5个不同的PSC亚群。其中PSC C4亚群特异性表达细胞表面标志物Cd55、Cd248和Vldlr，GO显示PSC C4在炎症反应、生长因子活性和脂质代谢相关通路富集，脂质代谢相关基因和转录因子Ebf2等表达上调，提示PSC C4具有较高的脂质代谢活性。上述结果提示CP中的PSCs有一定的异质性，PSCs C4表现出脂质代谢的增加，可能在胰腺纤维化的发展中发挥关键作用。

PSCs中特异敲除VLDLR能缓解CP胰腺纤维化

作者首先探究PSCs C4中脂质代谢上调的潜在机制，发现PSCs C4中脂质清除受体Vldlr和Cd36高表达。由于Cd36主要表达在内皮细胞，作者重点关注了VLDLR。作者从CP小鼠中分离出VLDLR+ PSCs和VLDLR- PSCs比较两者脂质摄取能力，发现VLDLR+ PSCs具有更高的脂蛋白摄取水平，脂质累积显著增加，表明VLDLR促进了PSCs中的脂蛋白摄取。

为了进一步确认VLDLR的在体影响，作者构建了PSC特异性敲除VLDLR的小鼠（vldlrΔPSC），发现PSCs中脂滴形成、脂蛋白摄取以及细胞内TG和胆固醇减少；在用酒精和雨蛙素诱导CP过程中vldlrΔPSC小鼠的胰腺炎症和纤维化症状显著弱于对照小鼠，这些结果表明PSCs中VLDLR的参与CP纤维化的进展。

氧化应激触发的VLDLR表达，促进PSCs摄取脂蛋白

生理条件下，VLDLR在静止PSCs中表达低，是什么因素触发了VLDLR在CP PSCs中上调呢？作者发现仅用VLDL刺激PSCs不能诱导VLDLR的表达。氧化应激是胰腺炎的一个重要标志。作者发现H₂O₂处理促进了PSC细胞中VLDLR表达，但是H₂O₂单独处理时PSCs的脂质积累却没有变化，只有VLDL和H₂O₂共同处理才能显著增加PSCs中VLDLR的表达、细胞内ROS、LD的形成和脂蛋白的摄取；在PSCs中特异性敲除Vldlr能缓解VLDL和H₂O₂诱导的氧化应激和脂质积累，用抗氧化剂处理PSC能降低VLDL和H₂O₂刺激诱导的PSCs中ROS积累、VLDLR的表达、LD的形成和脂蛋白的摄取。这表明氧化应激能促进VLDLR摄取VLDL从而增强脂质堆积。

PSCs特异性敲除IL-33可改善胰腺纤维化

VLDLR+ PSCs如何促进胰腺纤维化的呢？考虑到IL-33在CP纤维化中的作用，作者首先检测了IL-33, 发现野生型CP小鼠胰腺中IL-33阳性细胞数量和IL-33蛋白水平显著高于健康小鼠，但是VldlrΔPSC CP小鼠胰腺中IL-33上调水平显著减低。这提示VLDLR+ PSCs很可能通过IL-33参与CP。为进一步确认IL-33的来源，作者构建了IL-33-EGFP小鼠，发现CP小鼠胰腺中IL-33-EGFP+细胞数量增加。 

作者进一步在IL-33敲除小鼠中验证了IL-33的作用：IL-33敲除的CP小鼠的胰腺炎症和纤维化显著缓解，而注射回输重组IL-33能阻断敲除带来的缓解效果；PSCs IL-33特异性敲除的小鼠（IL33ΔPSC）在诱导CP后纤维化、恶性程度显著弱于WT小鼠。这证实了PSC分泌的IL-33是促进胰腺纤维化的调节因子。

最后，为了探究IL-33是否参与VLDLR+ PSCs介导的胰腺纤维化，作者在CP诱导过程中回输IL-33刺激小鼠，发现IL-33显著抑制了VldlrΔPSC CP小鼠的纤维化改善水平，提示VLDLR+PSCs 通过IL-33促进CP纤维化。

VLDLR介导的脂质堆积可促进PSCs中IL-33的表达

PSCs中VLDLR调控IL-33表达的机制是什么？作者发现，抑制VLDLR可降低PSCs中脂蛋白代谢物积累和IL-33的表达，提示VLDLR可能通过PSCs中的脂质累积诱导IL-33表达。细胞内VLDL先降解为TG, TG又降解为各种FAs和甘油，TG及其产物可能参与炎症调控。作者检测PSCs中的TG及其代谢物后发现，VLDL和H2O2处理增加了TG和多不饱和脂肪酸水平（如LA和PA）；用LA和PA处理PSCs时，LA和PA以剂量依赖的方式上调IL-33 mRNA的水平。这表明VLDL降解代谢物调控IL-33的表达。

为了寻找调控IL-33表达的转录因子，作者分析scRNA-seq数据，发现Il33高表达细胞中转录因子Ebf2表达量高于Il33低表达细胞。实验验证发现，IL-33-eGFP+ PSCs中Ebf2表达水平高于对照细胞，CP胰腺组织中IL-33与EBF2共表达。染色质免疫沉淀表明LA能促进EBF2和IL-33启动子相结合（而PA不能），在PSCs中敲低Ebf2阻断了LA刺激诱导的IL-33表达上调。上述结果表明TG代谢物LA通过增强EBF2转录活性来促进IL-33表达。

VLDL代谢物诱导的内质网应激促进IL-33的释放

IL-33可通过致死分泌和非致死分泌两条途径释放到细胞外作为损伤警报因子。VLDLR+ PSCs是如何释放IL-33的呢？作者发现，VLDL及其降解产物LA和PA处理能促进IL-33的分泌，但是VLDL和H2O2、LA和PA处理均不影响PSCs的细胞数量，表明CP PSCs中IL-33是非致死分泌的。

细胞内脂质堆积往往伴随脂质毒性上调，导致细胞内ROS过剩，促进氧化应激和内质网应激。作者发现LA能诱导PSCs中ROS和IL-33上调，而抗氧化剂则抑制ROS和IL-33的上调。更重要的是，抗氧化剂抑制了LA诱导的IL-33的分泌。这表明LA诱导的细胞内ROS积累促进了IL-33的分泌。

内质网应激是否参与ROS促进的IL-33分泌呢？LA或PA处理可以诱导PSCs中内质网应激，而抗氧化剂则降低了内质网应激标志物水平。此外，内质网应激抑制剂牛磺酸去氧胆酸或P38抑制剂能抑制ROS诱导的IL-33分泌，表明内质网应激参与IL-33的分泌。动物实验中，LA分别促进EBF2对IL-33转录调节和内质网应激，促进IL-33释放，诱导胰腺纤维化，进一步支持了上述结论。

IL-33激活ILC2直接介导PSC的增殖和活化

接下来，作者研究了IL-33调控CP进展的机制。作者发现CP小鼠胰腺中有大量2型免疫细胞，如ILC2、M2样巨噬细胞和Th2细胞。在人胰腺活检样本中，CP组织中ILC2水平显著高于正常组织。CP小鼠胰腺中2型细胞因子水平上调，而ILC2是CP组织中2型细胞因子的主要来源；与对照小鼠相比，Il33ΔPSC小鼠或VldlrΔPSC CP小鼠中2型免疫细胞和细胞因子水平显著降低，提示PSCs中VLDLR和IL- 33通过诱导2型免疫细胞和细胞因子促进CP进程。

大量研究表明ST2（IL33的受体）-IL-1RAcP是IL-33诱导纤维化的下游通路。作者发现IL-1敲除的CP小鼠纤维化明显减少，表明IL-33通过ST2-IL-1RAcP信号通路促纤维化。先前研究表明ST2表达于胰腺组织中的PSCs、肌成纤维细胞和免疫细胞表面。作者通过嵌合体小鼠模型和scRNA-seq数据发现ILC2是IL-33在CP中的主要靶细胞。进一步，作者发现ILC-2通过分泌2型细胞因子促进PSCs的激活和纤维化。

总结

溶慢性胰腺炎（CP）伴有显著的脂蛋白紊乱和脂代谢异常，然而脂代谢在CP纤维化中的作用尚不明确。本研究发现VLDL及其代谢产物是激活PSCs的关键，CP中存在高表达VLDLR的脂代谢活跃的PSCs，VLDL在进入PSCs后降解为LA，促进氧化应激，诱导损伤细胞因子IL-33的表达和分泌。IL-33分泌后与ILC2的表面受体ST2结合促使ILC2分泌2型细胞因子诱导2型免疫细胞的增殖和细胞因子分泌，并促进PSCs的活化、增殖，最终导致CP的炎症和纤维化。本研究首次系统地阐明了CP中脂代谢诱导PSCs活化促进纤维化的机制，同时也为其他纤维化疾病的治疗提供了新思路。

文：阿司匹林 SHCP

责编：Rena

链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1074761322002394

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